重复结构和极端 GC 含量是合成问题的主要影响因素。下列规则可指导您进行设计。但是，请注意，您可以通过限制重复序列和均衡 GC 含量来提高成功的概率。

例如，如果您有一个总 GC 含量为 66% 的基因，您必须把它降低到至少 65% 时才能合成它，但如果进一步将其降低到 60% 及以下，这个基因的合成成功率更高。这同样有利于消除重复序列、减少均聚物延伸以及消除 GC 窗口中的极端基因突变。越能避免或减少基因中存在这种结构，就越有可能成功合成基因。

规则

• 避免重复序列 ≥ 20 bp 或 Tm ≥ 60 ℃ 的情况，且整体 GC 含量必须保持在 25% 到 65% 之间
• 避免基因内部 GC 含量差异过大（即最高和最低 50 bp 延伸片段之间的 GC 含量差异应不大于 52%）
• 最小化均聚物，最小化分散在整个序列中的小片段重复序列的数量/长度
• 对于 HIS 标签，需将 CAC 和 CAT 密码子结合使用，即 CACCAT