利用 Twist Bioscience 基因进行酵母工程，以建设微生物药厂

Relying on existing agricultural practices and global supply chains to furnish medicinal products derived from plants is a recipe for drug shortages. This very situation arose in late 2019 when the FDA reported a shortage of vincristine derived from periwinkle, an essential chemotherapy drug for treating childhood cancer. In a recent issue of Nature, Stanford researchers Christina Smolke and Prashanth Srinivasan present an alternative approach to plant-derived drug synthesis: genetically engineered baker’s yeast.  

Baker 酵母为什么对基因工程和药物生产有用？

许多常见的药物是从植物中提取的，因为它们的化学合成过于昂贵，或对其了解甚少。两种这样的药物包括莨菪碱和东莨菪碱。医生开具这些复方药物，以治疗从帕金森氏病到晕车等疾病。这些复方药物是从茄属植物中提取的，其可用性在很大程度上取决于农业和全球供应链，因此容易受到区域和国际危机的影响。 

The FDA currently reports Scopolamine as “in shortage” and reported the same for hyoscyamine in 2019. To combat such shortages, researchers are looking into microbial fermentation-based biosynthesis as a platform for highly scalable drug synthesis operating outside the agricultural constraints for plant-derived compounds. Yeast grows much faster than plants, is relatively simple to modify its metabolism, and humankind already has a long history of microbial fermentation for high-value products. However, yeast doesn’t naturally make plant metabolites, so it first needs to be engineered.

In their 2020 study, Smolke and Srinivasan presented the first strain of yeast capable of synthesizing both hyoscyamine and scopolamine. This feat required thirty-four metabolic modifications in total – including twenty-six gene additions and eight gene deletions. Critically, the authors’ work highlights how Twist Gene Fragments can be used to transplant entire functional biosynthetic pathways from plants to baker’s yeast. 

用于生产药用化合物的酵母工程

Smolke 和 Srinivasan 从预先设计的酵母菌株开始，以合成两种药物的关键前体 —— 托品碱。然后，作者对该菌株进行了工程改造，以合成称为 PLA 葡萄糖苷的第二种前体。托品碱和 PLA 葡萄糖苷可自发形成第三个前体 —— 阿托品杂质。然后，一系列的酶促步骤可以修改阿托品杂质，以生产药用化合物莨菪碱和东莨菪碱。 

重新创建这些步骤并不像将生物合成酶从植物转移到酵母中那样简单。某些植物酶在酵母中的功能较差。其他的必须被运输到整个植物细胞中，以获取功能上关键的翻译后修改。此外，尚未发现产生莨菪碱的酶（该通路的倒数第二个步骤）。

这些问题中的一些已经很简单地解决了。以植物酶为例，该酶产生 PLA 糖苷合成的前体。仅在酵母中表达植物酶是不能产生功能性反应的。庆幸的是，细菌和其他酵母菌也可以表达类似的酶。Smolke 和 Srinivasan 在其酵母菌株中筛选了一系列候选酶，以检测在酵母菌株中的活性，并从选定了一种大型酵母 —— 荧光威克酵母。

在生物合成通路中发现倒数第二个酶更具挑战性。Smolke 和 Srinivasan 首先探索在线数据库中可用的丰富基因组数据，以获取与已知的托烷生物碱生物合成基因同时具有活性的基因。确定了 12 个潜在候选基因之后，作者筛选了他们产生东莨菪碱的能力。此筛选导致发现了莨菪碱脱氢酶，即产生莨菪碱的酶。

到目前为止，最复杂的工程问题是使酵母合成阿托品杂质。在植物中，负责阿托品杂质合成的酶必须先通过一系列细胞区室（称为分泌通路），然后才能发挥功能。通过分泌通路的传递有助于蛋白质通过添加翻译后修改而成熟。分泌通路是终止于液泡中或细胞外是取决于蛋白质的。尽管酵母和植物都含有这种通路，但是在酵母中表达植物酶是不可行的。要进入液泡，蛋白质需要知道正确的“密码”。简单地说，植物和酵母的密码完全不同，因此该酶被所在外部，从而无法起作用。

还有另一种将蛋白质带入酵母液泡的方法。Smolke 和 Srinivasan 认为，他们可以通过将酶伪装成分泌通路膜上的一类特殊蛋白质，从而利用蛋白质工程技术来绕过此要求密码的过程。这些蛋白质是有效的VIP，可自动通过包括液泡在内的整个分泌通路。 

弄清楚了如何将阿托品杂质合成酶转运到液泡中之后，剩下的全部就是将托品醇（一种阿托品杂质的前体）运到相同的位置。值得庆幸的是，植物已经解决了这个问题，拥有一种蛋白质能够将化学物质横跨液泡膜进行运输。通过在酵母中表达这种蛋白质，生物合成通路就完成了。 

用于酵母工程与微生物发酵 Twist Bioscience 基因片段

在酵母中重建托烷生物碱的生物合成中，Smolke 和 Srinivasan 利用 Twist Bioscience 基因片段表达了所有非酵母基因。其中包括来自植物的直接酶“移植物”，修改的植物酶，生物碱转运蛋白、和从其他真核生物中衍生的酶。Twist Bioscience 基因片段可实现即插即用克隆，并受益于业界领先的低错误率，简化了复杂的生物合成通路的构建。

尽管该项研究代表了重要的合成生物学成就，但仍需要将这种微生物发酵过程的 30-80 µg/L 产量提高至商业生产水平（〜5 g/L）。Smolke 和 Srinivasan 指出，这可以通过优化构成其生物合成通路的酶，以及识别有助于细胞内途径的新蛋白质来实现。即使如此，这项开创性技术还是科学文献中提出的最复杂的合成代谢通路之一，为产生源自植物的复杂治疗化合物提供了前景有望的解决方案。