Ingénierie de la levure avec les gènes Twist Bioscience pour développer une usine de médicaments microbiens

Relying on existing agricultural practices and global supply chains to furnish medicinal products derived from plants is a recipe for drug shortages. This very situation arose in late 2019 when the FDA reported a shortage of vincristine derived from periwinkle, an essential chemotherapy drug for treating childhood cancer. In a recent issue of Nature, Stanford researchers Christina Smolke and Prashanth Srinivasan present an alternative approach to plant-derived drug synthesis: genetically engineered baker’s yeast.  

Pourquoi la levure de boulangerie est-elle utile pour l’ingéniérie génétique et la production de médicaments ?

De nombreux médicaments ordinaires sont extraits de plantes parce que leur synthèse chimique est trop coûteuse ou mal maîtrisée. Deux de ces médicaments sont l’hyoscyamine et la scopolamine. Les médecins prescrivent ces composés pour traiter des affections allant de la maladie de Parkinson au mal des transports. Extraits des plantes de la morelle, la disponibilité de ces composés dépend essentiellement de l’agriculture et des chaînes d’approvisionnement mondiales, ce qui les rend sensibles aux crises régionales et internationales. 

The FDA currently reports Scopolamine as “in shortage” and reported the same for hyoscyamine in 2019. To combat such shortages, researchers are looking into microbial fermentation-based biosynthesis as a platform for highly scalable drug synthesis operating outside the agricultural constraints for plant-derived compounds. Yeast grows much faster than plants, is relatively simple to modify its metabolism, and humankind already has a long history of microbial fermentation for high-value products. However, yeast doesn’t naturally make plant metabolites, so it first needs to be engineered.

In their 2020 study, Smolke and Srinivasan presented the first strain of yeast capable of synthesizing both hyoscyamine and scopolamine. This feat required thirty-four metabolic modifications in total – including twenty-six gene additions and eight gene deletions. Critically, the authors’ work highlights how Twist Gene Fragments can be used to transplant entire functional biosynthetic pathways from plants to baker’s yeast. 

L’ingénierie de la levure pour la création de composés médicinaux

Smolke et Srinivasan ont commencé par utiliser une souche de levure conçue pour synthétiser un précurseur clé des deux médicaments, la tropine. Les auteurs ont ensuite modifié cette souche pour qu’elle synthétise un précurseur secondaire appelé PLA glucoside. La tropine et le PLA glucoside forment naturellement un troisième précurseur, la littorine. Une série d’étapes enzymatiques peut ensuite modifier la littorine pour produire les composés médicinaux hyoscyamine et scopolamine. 

La reconstitution de ces étapes n’a pas été aussi simple que le transfert des enzymes biosynthétiques des plantes dans la levure. Certaines enzymes végétales fonctionnent mal dans la levure. D’autres doivent être transportées dans toute la cellule végétale pour subir des modifications post-traductionnelles essentielles à leur fonctionnement. En outre, l’enzyme qui produit l’hyoscyamine, l’avant-dernière étape de la voie, n’avait pas encore été découverte.

Certains de ces problèmes ont été résolus assez simplement. Par exemple, l’enzyme végétale qui génère les précurseurs de la synthèse des glucosides de l’APL. La simple expression de l’enzyme végétale dans une levure n’a pas permis de produire une réaction fonctionnelle. Heureusement, les bactéries et d’autres espèces de levures expriment également des enzymes similaires. Smolke et Srinivasan ont analysé une série d’enzymes candidates à l’activité dans leur souche de levure et ont trouvé celle de Wickerhamia fluorescens, une espèce de grande levure.

La découverte de l’avant-dernière enzyme de la voie de biosynthèse a été plus difficile. Smolke et Srinivasan ont commencé par explorer la richesse des données génomiques disponibles dans les bases de données en ligne pour trouver des gènes qui sont actifs en même temps que les gènes connus de la biosynthèse des alcaloïdes de tropane. Après avoir identifié 12 candidats potentiels, les auteurs les ont analysés pour vérifier leur capacité à produire de la scopolamine. Cette analyse a conduit à la découverte de l’hyoscyamine déshydrogénase, l’enzyme qui produit l’hyoscyamine.

Le problème d’ingénierie le plus complexe, et de loin, a été de réussir à faire synthétiser la littorine par la levure. Pour les plantes, l’enzyme responsable de la synthèse de la littorine doit passer par une série de compartiments cellulaires (appelés voie sécrétoire) avant de devenir fonctionnelle. Le passage par la voie sécrétoire permet la maturation des protéines par l’ajout de modifications post-traductionnelles. La voie sécrétoire se termine soit dans la vacuole, soit à l’extérieur de la cellule, selon la protéine. Bien que les levures et les plantes contiennent cette voie, l’expression de l’enzyme végétale dans la levure n’a pas fonctionné. Pour entrer dans une vacuole, une protéine doit connaître le bon « mot de passe ». Pour faire simple, les mots de passe des plantes et de la levure sont totalement différents, de sorte que l’enzyme est bloquée et incapable de fonctionner.

Il existe un deuxième moyen de faire entrer une protéine dans une vacuole de levure. Smolke et Srinivasan ont décidé de faire appel à l’ingénierie des protéines pour contourner ce mot de passe en dissimulant l’enzyme sous la forme d’une catégorie spécifique de protéines situées sur les membranes de la voie de sécrétion. Ces protéines, de par leur importance, réussissent à passer automatiquement par l’ensemble de la voie de sécrétion, y compris la vacuole. 

Après avoir compris comment transporter la littorine synthétase dans la vacuole, il ne restait plus qu’à transporter la tropine (un précurseur de la littorine) au même endroit. Heureusement, les plantes ont déjà résolu ce problème et possèdent une protéine qui transporte le produit chimique à travers la membrane de la vacuole. En exprimant cette protéine dans la levure, la voie de biosynthèse était complète. 

Fragments de gène Twist Bioscience pour l’ingénierie de la levure et la fermentation microbienne

Pour recréer la biosynthèse des alcaloïdes tropicaux dans la levure, Smolke et Srinivasan ont employé des fragments de gène Twist Bioscience pour exprimer tous les gènes autres que ceux de la levure. Cela inclut les « greffes » directes d’enzymes provenant de plantes, les enzymes végétales modifiées, les transporteurs d’alcaloïdes et les enzymes dérivées d’autres eucaryotes. Les fragments de gène Twist Bioscience facilitent le clonage et bénéficient d’un faible taux d’erreur, ce qui simplifie la constitution de voies de biosynthèse complexes. 

Bien que cette étude constitue une avancée majeure en biologie de synthèse, des efforts restent à faire pour augmenter le rendement de 30-80 µg/L de ce procédé de fermentation microbienne à des niveaux de production commerciale (~5 g/L). Smolke et Srinivasan notent que ce résultat serait possible en optimisant les enzymes qui composent leur voie de biosynthèse ainsi qu’en identifiant de nouvelles protéines susceptibles de faciliter le routage intracellulaire. Pour autant, cette technologie novatrice est l’une des voies métaboliques de synthèse les plus complexes présentées dans la littérature scientifique, offrant une solution prometteuse pour la génération de composés thérapeutiques complexes dérivés de plantes.