Gentechnische Veränderung von Backhefe mit Twist Genes zur Errichtung einer mikrobiellen Arzneimittelfabrik

Relying on existing agricultural practices and global supply chains to furnish medicinal products derived from plants is a recipe for drug shortages. This very situation arose in late 2019 when the FDA reported a shortage of vincristine derived from periwinkle, an essential chemotherapy drug for treating childhood cancer. In a recent issue of Nature, Stanford researchers Christina Smolke and Prashanth Srinivasan present an alternative approach to plant-derived drug synthesis: genetically engineered baker’s yeast.  

Warum ist Backhefe für die Gentechnik und die Arzneimittelherstellung nützlich?

Viele gängige Arzneimittel werden aus Pflanzen extrahiert, weil ihre chemische Synthese unerschwinglich oder noch nicht vollständig erforscht ist. Zwei solche Wirkstoffe sind Hyoscyamin und Scopolamin. Ärzte verschreiben diese Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen, die von der Parkinson-Krankheit bis zur Reisekrankheit reichen. Die Verfügbarkeit dieser Verbindungen, die aus Nachtschattengewächsen gewonnen werden, hängt entscheidend von der Landwirtschaft und den globalen Lieferketten ab, sodass die Verbindungen anfällig für regionale und internationale Krisen sind. 

The FDA currently reports Scopolamine as “in shortage” and reported the same for hyoscyamine in 2019. To combat such shortages, researchers are looking into microbial fermentation-based biosynthesis as a platform for highly scalable drug synthesis operating outside the agricultural constraints for plant-derived compounds. Yeast grows much faster than plants, is relatively simple to modify its metabolism, and humankind already has a long history of microbial fermentation for high-value products. However, yeast doesn’t naturally make plant metabolites, so it first needs to be engineered.

In their 2020 study, Smolke and Srinivasan presented the first strain of yeast capable of synthesizing both hyoscyamine and scopolamine. This feat required thirty-four metabolic modifications in total – including twenty-six gene additions and eight gene deletions. Critically, the authors’ work highlights how Twist Gene Fragments can be used to transplant entire functional biosynthetic pathways from plants to baker’s yeast. 

Gentechnische Veränderung von Backhefe für die Herstellung von Arzneimitteln

Smolke und Srinivasan begannen mit einem Hefestamm, der vorab gentechnisch modifiziert wurde, um Tropin, einen zentralen Vorläufer beider Wirkstoffe, zu synthetisieren. Anschließend führten die Autoren eine gentechnische Veränderung dieses Stamms durch, um einen sekundären Vorläufer namens PLA-Glucosid zu synthetisieren. Tropin und PLA-Glucosid bilden spontan einen dritten Vorläufer – Littorin. Eine Reihe von enzymatischen Schritten kann dann Littorin modifizieren, um die medizinischen Verbindungen Hyoscyamin und Scopolamin zu erzeugen. 

Die Nachbildung dieser Schritte war schwieriger als die Übertragung der Biosyntheseenzyme von Pflanzen in Hefe. Einige pflanzliche Enzyme wirken in Hefe schlecht. Andere müssen in die gesamte Pflanzenzelle transportiert werden, um funktionskritische posttranslationale Modifikationen zu erzielen. Darüber hinaus war das Enzym, das Hyoscyamin produziert – der vorletzte Schritt auf dem Stoffwechselweg – noch nicht nachgewiesen worden.

Einige dieser Probleme wurden einfach gelöst, z. B. im Zusammenhang mit dem Pflanzenenzym, das Vorläufer für die PLA-Glucosidsynthese erzeugt. Die Expression des Pflanzenenzyms in Hefe allein führte nicht zu einer funktionellen Reaktion. Glücklicherweise exprimieren Bakterien und andere Hefespezies ähnliche Enzyme. Smolke und Srinivasan untersuchten eine Reihe von Kandidatenenzymen auf Aktivität in ihrem Hefestamm und landeten bei einem von Wickerhamia fluorescens, einer Art großer Hefe.

Der Nachweis des vorletzten Enzyms im Biosyntheseweg war schwieriger. Smolke und Srinivasan begannen damit, die Fülle der in Online-Datenbanken verfügbaren Genomdaten nach Genen zu durchsuchen, die gleichzeitig mit bekannten Tropan-Alkaloid-Biosynthesegenen aktiv sind. Die Autoren identifizierten 12 potenzielle Kandidaten und analysierten sie auf ihre Fähigkeit, Scopolamin zu produzieren. Diese Analyse führte zum Nachweis der Hyoscyamin-Dehydrogenase, des Enzyms, das Hyoscyamin produziert.

Das mit Abstand komplexeste technische Problem bestand darin zu erreichen, dass Hefe Littorin synthetisiert. In Pflanzen muss das für die Littorinsynthese verantwortliche Enzym eine Reihe von Zellkompartimenten (als sekretorischer Weg bezeichnet) durchlaufen, bevor es funktionsfähig wird. Die Passage durch den sekretorischen Weg hilft Proteinen, durch Hinzufügen von posttranslationalen Modifikationen zu reifen. Der sekretorische Weg endet je nach Protein entweder in der Vakuole oder außerhalb der Zelle. Zwar weisen Hefe und Pflanzen diesen Stoffwechselweg auf, die Expression des Pflanzenenzyms in Hefe funktionierte jedoch nicht. Um in eine Vakuole einzudringen, muss ein Protein das richtige „Passwort“ kennen. Einfach ausgedrückt, Pflanzen- und Hefepasswörter sind völlig unterschiedlich, sodass das Enzym gesperrt ist und nicht mehr funktioniert.

Es gibt eine zweite Möglichkeit, ein Protein in eine Hefevakuole einzubringen. Smolke und Srinivasan argumentierten, dass sie Protein Engineering verwenden könnten, um diese Passwortanforderung zu umgehen, indem sie das Enzym als eine bestimmte Klasse von Proteinen tarnen, die auf den Membranen des sekretorischen Weges sitzen. Diese Proteine sind im Grunde VIPs und können den gesamten sekretorischen Weg, einschließlich der Vakuole, automatisch passieren. 

Nachdem man herausgefunden hatte, wie Littorinsynthetase in die Vakuole transportiert werden kann, musste noch ermittelt werden, wie sich Tropin (ein Littorinvorläufer) an dieselbe Stelle transportieren lässt. Zum Glück haben Pflanzen dieses Problem bereits gelöst; sie verfügen über ein Protein, das die Chemikalie über die Vakuolenmembran transportiert. Durch die Expression dieses Proteins in Hefe war der Biosyntheseweg vollständig. 

Twist Gene Fragments für die gentechnische Veränderung und mikrobielle Fermentation von Hefe

Bei der Nachbildung der Tropan-Alkaloid-Biosynthese in Hefe verwendeten Smolke und Srinivasan Twist Gene Fragments, um alle Nicht-Hefe-Gene zu exprimieren. Dazu gehören direkte Enzym-„Transplantate“ von Pflanzen, modifizierte Pflanzenenzyme, Alkaloidtransporter und Enzyme, die von anderen Eukaryoten stammen. Twist Gene Fragments ermöglichen das „Plug-and-Play“-Klonen und profitieren von einer branchenführenden niedrigen Fehlerrate, die den Aufbau komplexer Biosynthesewege vereinfacht. 

Obwohl diese Studie eine bedeutende Errungenschaft in der synthetischen Biologie darstellt, ist noch viel Arbeit erforderlich, um die Produktionsmenge von 30 bis 80 µg/l bei diesem mikrobiellen Fermentationsprozess auf ein kommerzielles Produktionsniveau (~5 g/l) zu steigern. Smolke und Srinivasan weisen darauf hin, dass dies erreicht werden könnte, indem die Enzyme, aus denen ihr Biosyntheseweg besteht, optimiert und neue Proteine identifiziert werden, die den intrazellulären Transport unterstützen können. Trotzdem ist diese bahnbrechende Technologie einer der komplexesten synthetischen Stoffwechselwege, die in der wissenschaftlichen Literatur vorgestellt werden, und bietet eine vielversprechende Lösung für die Erzeugung komplexer therapeutischer Verbindungen aus Pflanzen.