Priprema krnjih oblika izoleucil-tRNA-sintetaze 2 iz bakterije Bacillus megaterium i karakterizacija njihove funkcionalnosti

ABSTRACT

Izoleucil-tRNA-sintetaza (IleRS) je enzim koji katalizira nastajanje izoleucil-tRNAIle u dva koraka; izoleucin se prvo aktivira uz pomoć ATP-a pa prenosi na tRNAIle . Enzim posjeduje modularnu građu s katalitičkom domenom koja je evolucijski najstarija. Izolacija samostojeće katalitičke domene zato predstavlja prvi korak u pripremi ancestralnih oblika. IleRS spada u skupinu drevnih i za život presudnih enzima što čini njegovu ancestralnu rekonstrukciju važnom za razumijevanje evolucije biosinteze proteina, ključnog staničnog procesa. U sklopu ovog diplomskog rada proizvedena su i kinetički okarakterizirana dva funkcionalno-minimalna (krnja) oblika IleRS2 iz bakterije Bacillus megaterium nastala uklanjanjem C-terminalne, korektivne i CP2 domene iz cjelovitog oblika. Topljivost krnjih oblika IleRS bila je niska što predstavlja veliki izazov za daljnja istraživanja. Kinetička karakterizacija pokazala je da oba krnja oblika posjeduju aminoacilacijsku aktivnost koja je 3-4 reda veličine manja nego kod cjelovite IleRS. Dobiveni rezultati ukazuju da su konstruirani krnji oblici IleRS2 dobri modeli za daljnje istraživanje ancestralnih oblika IleRS.