Engineering of xylose reductase based on ancestral sequence reconstruction

ABSTRACT

Rekonstrukcijom 350 sekvenci ksiloza reduktaze formirano je filogenetsko stablo i za 15 enzima odabrani su kinetički parametri za supstrat (D-ksiloza) i kofaktor (NADH). Temeljem ovih kriterija odabrano je pet ancestora, N0, N5, N15, N17 i N22, za inženjerstvo ksiloza reduktaze. Nakon što je pet proteina s His-tagom eksprimirano u E. coli BL21(DE3), slijedilo je njihovo pročišćavanje. Enzimi N15 i N22 su pokazali selektivnost prema D-ksilozi z NADH kao kofaktor. N17 brže konvertira D-ksilozu uz NADH nego uz NADPH kao kofaktor. Između pet ancestora, N15 ima najveću termostabilnost (Tm = 74.5°C). Ukoliko se usporede s postojećim enzimima, N15, N17 i N22 iskazuju nižu specifičnu aktivnost i katalitičku učinkovitost za D-ksilozu i NADH. Iako kataliza pomoću N17 ksiloza reduktaze ima potencijal primjene zbog afiniteta prema NADH, potrebna su daljnja istraživanja tri ancestora s ciljem optimiranja prije njihove eventualne primjene u industrijskoj proizvodnji ksilitola.