Twist 密码子优化工具根据所选生物体的密码子偏好性随机分配同义密码子。以下列出了优化期间的注意事项：

• 我们会更多地分配更常用的密码子，而非较不常用的密码子
• 我们避免使用罕见密码子（频率小于 8% 的密码子）
• 我们确保所得序列的前 48 个碱基对中不含强发夹 (∆G < -8)
• 我们对两条链都进行了检查，以确保它们不包含无需创建的酶切位点
• 我们通过避免产生强 sigma70 结合位点来防止在表达序列内部引入启动子序列
• 我们避免出现包含强核糖体结合位点（GGAGG 和 TAAGGAG）的序列
• 我们避免出现包含终止序列（TTTTT 或 AAAAA）的序列。由于分配的并非总是最优选的密码子，因此在每次优化尝试后，预计不会有相同的输出（并非将密码子 1:1 分配给氨基酸）。
• 如果多次优化相同的序列，预计会出现一个不同的优化序列。

请注意，对于任何经过 Twist 优化的序列，不能保证最优表达，因为有许多因素参与质量表达，其中一些因素尚未参透。

其他因素，如 mRNA 稳定性、蛋白质饱和度、翻译速度、伴侣蛋白表达、启动子设计、表达载体等也会影响表达。