リキッドバイオプシーワークフロー向けメチル化検出の強化
リキッドバイオプシー技術は、がんの早期検出やモニタリングのあり方を急速に変革しています。低侵襲なアプローチを提供するリキッドバイオプシーでは、cfDNA（セルフリーDNA）などの循環バイオマーカーを解析でき、がんに関連する遺伝的・エピジェネティック変化に関する貴重な情報を得られます。これらのバイオマーカーの中でもDNAメチル化の変化は、高い特異性と感度をもってさまざまながんを特定・追跡できる有望な手段として注目されています。
しかし、cfDNAは存在量が限られ、特有の断片化パターンを示すため、利用には独自の課題が伴います。cfDNA断片の大半は長さが約167bpで、ヌクレオソームに由来することを反映しています。この断片化により、以下の問題が生じます：
- ストップ・スタート多様性の低下により、実際はユニークな分子であっても重複リードとして扱われる傾向が増える
- ライブラリの複雑性が低下し、アッセイの感度が損なわれる可能性がある
これらの固有の特性によって従来のメチル化検出ワークフローではcfDNA解析が十分に行えず、これらの制約に対応するための高度なツールや技術が求められます。
Twistメチル化UMIアダプターは、ユニーク分子識別子（UMI）を用いた正確な重複除去を可能にし、低多様性のサンプルにおける誤った重複判定を削減することで、cfDNAのメチル化ワークフローを向上させます。これらのアダプターはEM-Seqプロトコールとの互換性を考慮した設計となっており、断片長を維持しつつ使用可能なデータを最大化して、ターゲットカバレッジと再現性を向上させます。そのため、高い信頼性が要求されるメチル化研究に欠かせないツールとなります。
リキッドバイオプシーワークフロー向けメチル化検出の強化
リキッドバイオプシー技術は、がんの早期検出やモニタリングのあり方を急速に変革しています。低侵襲なアプローチを提供するリキッドバイオプシーでは、cfDNA（セルフリーDNA）などの循環バイオマーカーを解析でき、がんに関連する遺伝的・エピジェネティック変化に関する貴重な情報を得られます。これらのバイオマーカーの中でもDNAメチル化の変化は、高い特異性と感度をもってさまざまながんを特定・追跡できる有望な手段として注目されています。
しかし、cfDNAは存在量が限られ、特有の断片化パターンを示すため、利用には独自の課題が伴います。cfDNA断片の大半は長さが約167bpで、ヌクレオソームに由来することを反映しています。この断片化により、以下の問題が生じます：
- ストップ・スタート多様性の低下により、実際はユニークな分子であっても重複リードとして扱われる傾向が増える
- ライブラリの複雑性が低下し、アッセイの感度が損なわれる可能性がある
これらの固有の特性によって従来のメチル化検出ワークフローではcfDNA解析が十分に行えず、これらの制約に対応するための高度なツールや技術が求められます。
Twistメチル化UMIアダプターは、ユニーク分子識別子（UMI）を用いた正確な重複除去を可能にし、低多様性のサンプルにおける誤った重複判定を削減することで、cfDNAのメチル化ワークフローを向上させます。これらのアダプターはEM-Seqプロトコールとの互換性を考慮した設計となっており、断片長を維持しつつ使用可能なデータを最大化して、ターゲットカバレッジと再現性を向上させます。そのため、高い信頼性が要求されるメチル化研究に欠かせないツールとなります。
重複解消を向上させるためのUMI導入
UMIを用いた重複判定により、ライブラリの重複数が15%以上削減され、標準的な位置ベースの重複判定と比べてライブラリの複雑性が25～35%、平均ターゲットカバレッジが6～8%向上します。（図1）
図 1: 可変なcfDNA投入量におけるUMIの性能
NEBNext EM-Seq ライブラリ調製に続いて、cfDNAを5、10、または15ng投入し、Twistメチル化UMIアダプターを用いてEM-seq変換ライブラリを作製しました。ライブラリはターゲットメチル化シーケンシングプロトコルを用いてTwist Alliance Pan-cancer Methylation Panel - 1.5MBでキャプチャし、Illumina Nextseqを使って550～1000倍の生データカバレッジまでシーケンスしました。重複リードの判定は、標準的な位置ベースの方法であるGATK MarkDuplicatesツール、またはUMIを用いたGATK UmiAwareMarkDuplicatesWithMateCigarツールで行いました。
図 2：Twistメチル化検出ワークフローにおけるメチル化UMIの性能
ヒトcfDNAを10ng使用して、NEB EMseqアダプターまたは新しいTwistメチル化UMIアダプターを用い、EM-seq変換ライブラリを作製しました。ライブラリは、ターゲットメチル化シーケンシングプロトコルを用いてTwist Alliance Pan-cancer Methylation Panel - 1.5MBでキャプチャし、Illumina Nextseqを使って550～1000倍の生データカバレッジまでシーケンスしました。
バイオインフォマティクスワークフローの例
UMI情報はバイオインフォマティクスのパイプラインに組み込み、下流解析に先立って重複リードを除去するために活用できます。
図 3．重複マーク処理のためにUMIを扱う解析ワークフローの概要
生リードはアダプター配列のマーキングとUMI情報の抽出のために処理されます。続いてリードをBWA-methでリファレンスゲノムにアラインし、UMI情報を使って重複マークを行います。重複マーク後は、GATKを用いてPicardメトリクスを収集し、追加の解析が可能です。
Figure 4. Schematic of Apoptotic cfDNA fragmentation to Sequencing Coverage:
During apoptosis, cell-free DNA (cfDNA) is released into the bloodstream. While endonucleases fragment DNA randomly, the way DNA is wrapped around nucleosomes introduces positional bias, leading to limited diversity in fragment start and stop sites. As a result, distinct molecules may appear as duplicates in sequencing data. Unique molecular identifiers (UMIs) are added during library preparation to label individual molecules, allowing for accurate differentiation between true duplicates and separate unique molecules.
重複解消を向上させるためのUMI導入
UMIを用いた重複判定により、ライブラリの重複数が15%以上削減され、標準的な位置ベースの重複判定と比べてライブラリの複雑性が25～35%、平均ターゲットカバレッジが6～8%向上します。（図1）
図 1: 可変なcfDNA投入量におけるUMIの性能
NEBNext EM-Seq ライブラリ調製に続いて、cfDNAを5、10、または15ng投入し、Twistメチル化UMIアダプターを用いてEM-seq変換ライブラリを作製しました。ライブラリはターゲットメチル化シーケンシングプロトコルを用いてTwist Alliance Pan-cancer Methylation Panel - 1.5MBでキャプチャし、Illumina Nextseqを使って550～1000倍の生データカバレッジまでシーケンスしました。重複リードの判定は、標準的な位置ベースの方法であるGATK MarkDuplicatesツール、またはUMIを用いたGATK UmiAwareMarkDuplicatesWithMateCigarツールで行いました。
図 2：Twistメチル化検出ワークフローにおけるメチル化UMIの性能
ヒトcfDNAを10ng使用して、NEB EMseqアダプターまたは新しいTwistメチル化UMIアダプターを用い、EM-seq変換ライブラリを作製しました。ライブラリは、ターゲットメチル化シーケンシングプロトコルを用いてTwist Alliance Pan-cancer Methylation Panel - 1.5MBでキャプチャし、Illumina Nextseqを使って550～1000倍の生データカバレッジまでシーケンスしました。
バイオインフォマティクスワークフローの例
UMI情報はバイオインフォマティクスのパイプラインに組み込み、下流解析に先立って重複リードを除去するために活用できます。
図 3．重複マーク処理のためにUMIを扱う解析ワークフローの概要
生リードはアダプター配列のマーキングとUMI情報の抽出のために処理されます。続いてリードをBWA-methでリファレンスゲノムにアラインし、UMI情報を使って重複マークを行います。重複マーク後は、GATKを用いてPicardメトリクスを収集し、追加の解析が可能です。
Figure 4. Schematic of Apoptotic cfDNA fragmentation to Sequencing Coverage:
During apoptosis, cell-free DNA (cfDNA) is released into the bloodstream. While endonucleases fragment DNA randomly, the way DNA is wrapped around nucleosomes introduces positional bias, leading to limited diversity in fragment start and stop sites. As a result, distinct molecules may appear as duplicates in sequencing data. Unique molecular identifiers (UMIs) are added during library preparation to label individual molecules, allowing for accurate differentiation between true duplicates and separate unique molecules.
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製品：Twist UMI アダプター - TruSeq Compatible、96サンプル110830
製品：Twist UMI アダプター - TruSeq Compatible、96サンプル
製品シート
