酵素スクリーニングキット

当社の酵素は特定の純度基準で製造されているわけではありません。細胞残渣や発酵成分から分離するよう努力されていますが、内因性タンパク質や緩衝塩が存在する場合があります。これらの追加コンポーネントは、しばしば安定性を高めます。

まだ大規模に生産されていない研究用酵素には有効期限を設定していません。しかし、私たちの経験では、-20℃で乾燥保存した場合、ほとんどの酵素は2年間安定した状態を保ちます。

キットに含まれる酵素は高い選択性を示し、通常(R)と(S)の選択性はほぼ等しくなります。基質が選択性に影響するような特異な構造をとることがあるため、過去の表記（下記の選択性の表を参照）だけに頼るのではなく、すべての酵素をスクリーニングすることをお勧めします。基質中に炭素以外の原子（ハロゲンや硫黄など）が存在すると、Cahn-Ingold-Prelog異性体の命名規則により、選択性が逆になる可能性があることに注意することが重要です。プロトコルのセクションにある選択性の表をご参照ください。

トランスアミナーゼの安定性と活性は、基質や生成物の違いなど、いくつかの相互依存的な要因によって変化します。以下は、スクリーニング後のさらなる最適化に役立つ性能パラメータを示す代表的なパラメータ表です。

ピルビン酸は、本キットに含まれるほとんどの酵素の一般的なアミン受容体として機能し、反応系のテストに最適です。

典型的な反応条件は、25 mMのアミンアクセプター、25 mMの2-(4-ニトロフェニル)エタン-1-アミン(アミンアクセプター)、100 mMのリン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)、および1 mMのピリドキサール5-リン酸(PLP)などです。

最初はpH7.4のリン酸カリウム緩衝液でスクリーニングすることをお勧めします。ヒットが特定されれば、緩衝液の種類とpHを最適化することができます。選択性は通常pHに依存しませんが、活性は異なる場合があります。ホウ酸緩衝液は高pHでの性能評価に適しています。

キットに含まれるほとんどの酵素は、共溶媒として最大10% v/v DMSOで安定性を保ちます。

キットに含まれる酵素はpH7～8.5の範囲で効果的に作用し、pH9～10に耐性を持つサブセットはわずかです。pHを7.0以下に下げることはお勧めしません。

安定性はそれぞれ異なりますが、一般的に20℃～60℃の間で作動します。詳細については、代表的なパラメータの表を参照してください。

基質がDMSOに可溶で、各バイアルに均等に添加できる場合、反応混合物中の部分的な不溶性は通常問題になりません。

反応時間を長くする、温度を高くする（40℃まで）、基質濃度を高くする、酵素濃度を高くするなどの方法を試してください。それでも問題が解決しない場合は、Twist®-bitBiome® TAスクリーニングキットに相談するか、Twistにお問い合わせください。また、ピルビン酸をアミン受容体としてコントロール反応を行い、反応溶液を確認することもできます。

反応を早めに止めるか、酵素負荷量を少なくしてスクリーニングを繰り返すことを検討してください。繰り返す場合は、DMSO濃度を<10% v/vに維持します。

反応条件の最適化については、トランスアミナーゼスクリーニングFAQをご参照ください。

代表的なアミンドナーとして、アラニン、エチルアミン、1-および2-プロピルアミン、1-および2-ブチルアミンなどがあります。これらのドナーのケトン／アルデヒド型は、キラル分離の際、良好なアミン受容体としても機能します。

その他のご質問については、トランスアミナーゼ スクリーニングに関するFAQをご参照いただくか、お気軽にお問い合わせください。

実験当日に新鮮な溶液を調製することをお勧めします。時間の経過とともに、基質と補酵素の両方が劣化し、反応全体の性能が低下する可能性があります。溶液の保存と再利用が必要な場合は、遮光して低温で保存してください。さらに、可能な限り新しい溶液と比較して性能を確認することをお勧めします。

多くの酵素では、反応混合物に10％v/vのDMSOを加え、温度を40～45℃に上げると、基質の溶解性が高まります。各酵素が許容する典型的な条件については、典型的なパラメータの表を参照してください。さらに、基質によって異なりますが、pHを上げると溶解性が高まるかもしれません。pHを7.0以下に下げることはお勧めしません。基質の溶解が不完全であることを示す反応混合物の白濁は、通常許容され、通常は反応の妨げにはなりません。すべての反応に均等に基質が行き渡るように、基質はそのままか、DMSO（または同様の溶媒）溶液から加えるのがベストです。

酵素の添加は、他の試薬や溶媒をすべて取り込み、pH調整が完了してから行うのが一般的に最適です。可能であれば、酵素を緩衝液に溶かしてから反応混合物に加えます。試薬の添加順序を変えることで、反応性能にプラスにもマイナスにも大きく影響することがあります。

酵素が変えることのできない性質（溶解度、pH、温度安定性など）であるため、基質と生成物の固有の性質を理解することが極めて重要です。さらに、副反応を促進したり、下流の問題につながったり、基質や製品と相容れない条件を避けることも重要です。異なるpHレベルでの反応性能の評価（推奨：pH7.4、9、10 pH7.4ではリン酸カリウム緩衝液、pH9、10ではホウ酸ナトリウムを使用）。最適なpHが決まったら、反応性能に対する温度の影響を調べます（推奨温度範囲：30～55°C）。さらに、性能を最適化するために、より高い基質負荷量で反応を評価することも検討してください。基質が反応混合物に溶解しない場合、基質の物質移動が制限される可能性があります。このような場合は、可溶化共溶媒の添加を検討してください。溶媒濃度の許容範囲については、代表的なパラメータの表を参照してください。DMSO以外にも、短鎖アルコール、DMF、THF、アセトニトリルなどの溶媒を検討することができます。

標準的な比色法を用いて、バッチごとに各酵素の活性をチェックします。これにより、各酵素が当社の活性基準を満たし、お客様のアプリケーションで確実に機能することが保証されます。

キットに含まれる特定の酵素の粉末溶解液をバッチごとに測定します。この測定により、適切な量の溶解液が確保され、当社のキットの有効性が保証されます。

環境安全性を確保するため、溶解液粉末中に生きた発現宿主（大腸菌など）が存在しないことを確認しています。このステップは、製品の安全性と完全性を維持するために非常に重要です。

各バッチの保存期間を確認するため、厳格なテストを行っています。これにより、当社の酵素キットは、使用予定期間中、効果的で安定した状態を保つことができます。

溶解液の粉末中に大腸菌のような生きた発現宿主が存在しないことは、潜在的な汚染を防ぎ、ユーザーと環境の安全を確保するために重要です。

比色法は、特定の基質と反応したときの色の変化に基づいて酵素の濃度を決定するために使用される技術です。酵素活性の信頼性の高い定量可能な測定値が得られるため、使用されています。

バッチが当社の厳しい品質基準を満たさない場合は、販売に供されません。その代わり、流通を再検討する前に、さらなる分析と問題点への是正措置が行われます。

当社の品質管理プロセスは、訓練を受けた専門家が操作する有効な方法と機器を使用して実施されます。また、業界標準やベストプラクティスへの継続的なコンプライアンスを確保するため、定期的な監査とレビューも実施しています。

はい、特定のバッチの詳細な品質管理レポートを要求することができます。これらの報告書は、受け取った酵素キットの品質と完全性に関する透明性と保証を提供します。