Twist Codon Optimizer Tool（コドン最適化ツール）は、選択された生物のコドンの傾向に基づいて、同義のコドンをランダムに割り当てます。ここでは、最適化の際に考慮すべき点を挙げます。

• より一般的なコドンが、そうでないコドンよりも高頻度で割り当てられます。
• 希少コドン（コドン頻度が 8％ 未満のもの）の使用は避けています。
• 得られた配列の最初の 48 塩基対に強いヘアピン（∆G < －8）がないようにしています。
• お客様から含めないようにご依頼された酵素切断部位が含まれていないことを DNA の二本鎖の両方で確認します。
• Sigma70 と強く結合する部位を作らないようにすることで、発現配列の内部にプロモーター配列を導入することを避けています。
• リボソームと強く結合する部位を作る配列（GGAGG、TAAGGAG）は避けています。
• ターミネーター配列（TTTTTやAAAAA）は避けています。
• 最も好ましいコドンが常に割り当てられるわけではないので、最適化を試みるたびに同じ結果が得られるとは限りません（コドンとアミノ酸の割り当ては１対１ではありません）。同じ配列に対して最適化を繰り返すと、得られる最適化配列は１回のみ最適化した時の配列とは異なっている可能性が高いでしょう。

なお、 Twist のツールを通して最適化を行った配列について、最適な発現を保証するものではありません。質の高い発現には多くの要因があり、その中にはよくわかっていないものもあるからです。

さらに、 mRNA の安定性、タンパク質の成熟、翻訳スピード、シャペロンの発現、プロモーターの設計、発現ベクターなどの要因も発現に影響を与えます。