Das Demultiplexing von Twist 96-Plex-Librarys unterscheidet sich vom Standardverfahren. Die Barcodes der einzelnen Proben befinden sich in einer Zeile als Teil von R1 und nicht an der Standardposition i5. Aus diesem Grund erkennen die Illumina-Tools bcl2fastq2 und BCLconvert den Barcode der einzelnen Proben nicht und kombinieren stattdessen während des Demultiplexing alle Wells zu einer einzigen FASTQ-Datei auf Plattenebene, die auf dem einzelnen i7-Index basiert. 

Um dieses Problem zu lösen, müssen 96-Plex-Benutzer einen zweistufigen Demux-Prozess durchführen. Zunächst müssen die BCL-Dateien für jeden Zyklus in eine FASTQ-Datei auf Plattenebene umgewandelt werden, und anschließend erfolgt eine zweite Umwandlung der FASTQ-Dateien auf Plattenebene in probenspezifische FASTQ-Dateien. Wir empfehlen die Verwendung der Open-Source-Software fgbio DemuxFastqs zur Erstellung von FASTQs pro Probe. Weitere Informationen finden Sie in der Demultiplexing-Anleitung auf der Twist-Website.