Kit de criblage enzymatique

Nos enzymes ne sont pas produites à une norme de pureté spécifique. Bien que des efforts soient déployés pour les séparer des débris cellulaires et des composants de fermentation, certaines protéines endogènes et sels tampons peuvent être présents. Ces composants supplémentaires améliorent souvent la stabilité.

Nous ne fixons pas de date de péremption aux enzymes de recherche qui n’ont pas encore été produites à grande échelle. Cependant, d’après notre expérience, si elles sont stockées au sec à -20°C, la plupart de nos enzymes restent stables pendant 2 ans.

Les enzymes du kit présentent une sélectivité élevée, avec généralement une répartition à peu près égale entre la sélectivité (R) et (S). Nous conseillons de cribler toutes les enzymes plutôt que de se fier uniquement à la notation historique (voir le tableau de sélectivité ci-dessous), car les substrats peuvent adopter des conformations inhabituelles qui affectent la sélectivité. Il est important de noter que la présence d’atomes autres que le carbone dans le substrat (par exemple, des halogènes ou du soufre) peut entraîner une sélectivité opposée en raison des conventions de dénomination des isomères de la nomenclature Cahn-Ingold-Prelog. Veuillez vous référer au tableau de sélectivité sous la section Protocoles.

La stabilité et l’activité des transaminases peuvent varier en raison de plusieurs facteurs interdépendants, notamment différents substrats et produits. Vous trouverez ci-dessous un tableau des paramètres typiques qui fournit des paramètres de performance susceptibles d’aider à affiner l’optimisation après le criblage.

L’acide pyruvique sert d’accepteur général d’amines pour la plupart des enzymes de ce kit ; il est idéal pour tester votre système de réaction.

Les conditions de réaction typiques comprennent un accepteur d’amines de 25 mM, une 2-(4-nitrophényl)éthane-1-amine de 25 mM (accepteur d’amines), un tampon de phosphate de potassium de 100 mM (pH 7,4) et un 5-phosphate de pyridoxal de 1 mM (PLP).

Nous recommandons dans un premier temps un criblage dans un tampon de phosphate de potassium de pH 7,4. Une fois que le ou les résultats(s) sont identifié(s), le type de tampon et le pH peuvent être optimisés. La sélectivité n’est généralement pas dépendante du pH, bien que l’activité puisse varier. Le tampon de borate convient à l’évaluation des performances à pH élevé.

La plupart des enzymes du kit restent stables avec jusqu’à 10 % v/v de DMSO comme co-solvant.

Les enzymes du kit fonctionnent efficacement dans une plage de pH de 7 à 8,5, un petit sous-ensemble tolérant un pH de 9 à 10. Il n’est pas recommandé d’abaisser le pH en dessous de 7,0.

Les variants présentent une stabilité différente, mais fonctionnent généralement entre 20 °C et 60 °C. Pour plus d’informations, reportez-vous au tableau des paramètres typiques.

Si le substrat est soluble dans le DMSO et peut être ajouté de manière égale à chaque flacon, l’insolubilité partielle dans le mélange réactionnel n’est généralement pas un problème.

Essayez de laisser la réaction durer plus longtemps, d’augmenter la température (à 40 °C), d’augmenter la concentration du substrat et/ou d’augmenter la concentration enzymatique. Si les problèmes persistent, envisagez de consulter le kit de criblage Twist®-bitBiome® TA ou contactez Twist pour explorer d’autres options. Vous pouvez également effectuer une réaction de contrôle en utilisant de l’acide pyruvique comme accepteur d’amines pour vérifier votre solution de réaction.

Envisagez d’arrêter la réaction plus tôt ou essayez de répéter le criblage en utilisant une charge enzymatique plus faible. En cas de répétition, maintenez la concentration de DMSO à < 10 % v/v.

Veuillez consulter notre FAQ sur le criblage des transaminases pour obtenir des suggestions sur l’optimisation des conditions de réaction.

Les donneurs d’amines typiques sont l’alanine, l’éthylamine, la 1- et 2-propylamine, la 1- et 2-butylamine, etc. La forme cétone/aldéhyde de ces donneurs agit également comme un bon accepteur d’amines lors de la résolution chirale.

Consultez notre FAQ sur le criblage des transaminases pour obtenir des réponses à d’autres questions que vous pourriez avoir, ou n’hésitez pas à nous contacter.

Nous recommandons de préparer des solutions fraîches le jour même de l’expérience. Au fil du temps, le substrat et le cofacteur peuvent se dégrader, ce qui pourrait réduire les performances globales de la réaction. S’il est nécessaire de stocker et de réutiliser la solution, elle doit être conservée au froid et à l’abri de la lumière. De plus, nous vous conseillons de vérifier ses performances par rapport à des solutions fraîches dans la mesure du possible.

Pour de nombreuses enzymes, l’incorporation de DMSO à 10 % v/v dans le mélange réactionnel et l’augmentation de la température à 40-45 °C peuvent améliorer la solubilité du substrat. Reportez-vous au tableau des paramètres typiques pour connaître les conditions typiques tolérées par chaque enzyme. De plus, l’augmentation du pH peut favoriser la solubilité, bien que cela varie en fonction du substrat. Nous vous déconseillons de baisser le pH en dessous de 7,0. La turbidité du mélange réactionnel, indiquant une solubilité incomplète du substrat, est généralement acceptable et n’entrave habituellement pas la réaction. Il est préférable d’ajouter le substrat pur ou à partir d’une solution DMSO (ou solvant similaire) pour assurer une distribution uniforme dans toutes les réactions.

Il est généralement optimal d'ajouter l'enzyme après l'incorporation de tous les autres réactifs et solvants, et l'ajustement du pH. Si possible, dissolvez l’enzyme dans un tampon avant de l’ajouter au mélange réactionnel. Parfois, la modification de l’ordre d’ajout des réactifs peut avoir un impact significatif, positif ou négatif, sur les performances de la réaction.

Il est crucial de comprendre la nature inhérente du substrat et du produit, car ce sont des propriétés que l’enzyme ne peut pas modifier (par exemple, la solubilité, le pH et la stabilité de la température). De plus, il est important d’éviter les conditions susceptibles de favoriser des réactions secondaires, d’entraîner des problèmes en aval ou d’être incompatibles avec le substrat ou le produit. Évaluez les performances de la réaction à différents niveaux de pH (recommandé : pH de 7,4, 9 et 10 à l’aide d’un tampon de phosphate de potassium au pH 7,4 et de borate de sodium au pH 9 et 10). Une fois qu’un pH optimal est déterminé, étudiez l’effet de la température sur les performances de la réaction (plage de température recommandée : 30 à 55 °C). De plus, envisagez d’évaluer la réaction à des charges de substrat plus élevées pour optimiser les performances. Si le substrat n’est pas soluble dans le mélange réactionnel, cela peut entraîner une limitation du transfert de masse du substrat. Dans de tels cas, envisagez d’étudier l’ajout d’un co-solvant solubilisant. Reportez-vous au tableau des paramètres typiques pour la tolérance en termes de concentration de solvant ; outre le DMSO, d’autres solvants tels que les alcools à chaîne courte, le DMF, le THF et l’acétonitrile peuvent également être explorés.

Nous vérifions l’activité de chaque enzyme dans chaque lot à l’aide d’une méthode colorimétrique standard. Cela garantit que chaque enzyme répond à nos normes d’activité et fonctionne de manière fiable dans vos applications.

Nous mesurons le lysat en poudre d’enzymes spécifiques dans le kit pour chaque lot. Cette mesure permet de s’assurer qu’il y a une quantité adéquate de lysat, pour garantir l’efficacité de nos kits.

Pour garantir la sécurité de l’environnement, nous confirmons qu’il n’y a pas d’hôtes d’expression vivants (tels que E. coli) dans la poudre de lysat. Cette étape est cruciale pour maintenir la sécurité et l’intégrité de notre produit.

Nous effectuons des tests rigoureux pour confirmer la durée de conservation de chaque lot. Cela garantit que nos kits d’enzymes restent efficaces et stables pendant toute la durée de leur utilisation prévue.

L’absence d’hôtes d’expression vivants, comme E. coli, dans la poudre de lysat est importante pour prévenir toute contamination potentielle et pour assurer la sécurité des utilisateurs et de l’environnement.

Une méthode colorimétrique est une technique utilisée pour déterminer la concentration d’une enzyme en fonction de son changement de couleur lorsqu’elle réagit à un substrat spécifique. On l’utilise parce qu’elle fournit une mesure fiable et quantifiable de l’activité enzymatique.

Si un lot ne répond pas à nos normes de qualité strictes, il n’est pas mis en vente. Au lieu de cela, il fait l’objet d’une analyse plus approfondie et de mesures correctives pour résoudre tout problème avant que sa distribution soit réenvisagée.

Nos processus de contrôle qualité sont effectués à l’aide de méthodes et d’équipements validés, exécutés par des professionnels formés. Des audits et des examens réguliers sont également effectués pour garantir le respect permanent des normes et des meilleures pratiques du secteur.

Oui, les clients peuvent demander des rapports de contrôle qualité détaillés pour leur lot spécifique. Ces rapports offrent transparence et assurance quant à la qualité et à l’intégrité du kit d’enzymes qu’ils reçoivent.