Ingeniería de las levaduras con genes Twist para crear una fábrica de fármacos antimicrobianos

Relying on existing agricultural practices and global supply chains to furnish medicinal products derived from plants is a recipe for drug shortages. This very situation arose in late 2019 when the FDA reported a shortage of vincristine derived from periwinkle, an essential chemotherapy drug for treating childhood cancer. In a recent issue of Nature, Stanford researchers Christina Smolke and Prashanth Srinivasan present an alternative approach to plant-derived drug synthesis: genetically engineered baker’s yeast.  

¿Por qué es útil la levadura de panadero para la ingeniería genética y la producción de fármacos?

Muchas medicinas comunes se extraen de plantas porque su síntesis química resulta prohibitiva o no se conoce bien. Dos de esos fármacos incluyen la hiosciamina y la escopolamina. Los médicos prescriben estos compuestos que tratan enfermedades que van desde la enfermedad de Parkinson hasta la cinetosis. Extraídos de las plantas de la belladona, la disponibilidad de estos compuestos depende principalmente de la agricultura y de las cadenas de suministro globales, lo que la hace susceptible a crisis regionales e internacionales. 

The FDA currently reports Scopolamine as “in shortage” and reported the same for hyoscyamine in 2019. To combat such shortages, researchers are looking into microbial fermentation-based biosynthesis as a platform for highly scalable drug synthesis operating outside the agricultural constraints for plant-derived compounds. Yeast grows much faster than plants, is relatively simple to modify its metabolism, and humankind already has a long history of microbial fermentation for high-value products. However, yeast doesn’t naturally make plant metabolites, so it first needs to be engineered.

In their 2020 study, Smolke and Srinivasan presented the first strain of yeast capable of synthesizing both hyoscyamine and scopolamine. This feat required thirty-four metabolic modifications in total – including twenty-six gene additions and eight gene deletions. Critically, the authors’ work highlights how Twist Gene Fragments can be used to transplant entire functional biosynthetic pathways from plants to baker’s yeast. 

Ingeniería de las levaduras usada para la generación de compuestos medicinales

Smolke y Srinivasan empezaron con una cepa de levadura sin modificar mediante ingeniería genética para sintetizar un precursor esencial de ambos fármacos, la tropina. A continuación, los autores modificaron esta cepa mediante ingeniería genética para sintetizar un precursor secundario denominado glucósido PLA. La tropina y el glucósido PLA formaron espontáneamente un tercer precursor, la litorina. A continuación, una serie de pasos enzimáticos pueden modificar la litorina para producir los compuestos médicos hiosciamina y escopolamina. 

La recreación de estos pasos no es tan sencilla como transferir las enzimas biosintéticas de las plantas a la levadura. Algunas enzimas vegetales funcionan mal en la levadura. Otras deben pasar por toda la célula vegetal para adquirir modificaciones postraduccionales funcionalmente críticas. Asimismo, la enzima que produce la hiosciamina, el penúltimo paso de la vía, todavía no se ha descubierto.

Algunos de estos problemas se solucionaron de forma sencilla. Tomemos, por ejemplo, la enzima vegetal que genera precursores para la síntesis del glucósido PLA. La simple expresión de la enzima vegetal en la levadura no llegó a producir una reacción funcional. Afortunadamente, las bacterias y otras especies de levaduras también expresan enzimas similares. Smolke y Srinivasan cribaron una serie de enzimas candidatas por su actividad en la cepa de levadura y llegaron a una de Wickerhamia fluorescens, una especie de levadura grande.

El descubrimiento de la penúltima enzima en la vía biosintética fue más complejo. Smolke y Srinivasan empezaron a extraer todos los datos del genoma disponibles en las bases de datos en línea de los genes que están activos al mismo tiempo que los genes de biosíntesis de alcaloides tropánicos conocidos. Cuando identificaron 12 candidatos posibles, los autores los cribaron en cuanto a su capacidad para producir escopolamina. Este cribado permitió el descubrimiento de la hiosciamina deshidrogenasa, la enzima que produce la hiosciamina.

El problema de ingeniería genética más complejo de lejos fue conseguir que la levadura sintetizara la litorina. En las plantas, la enzima responsable de la síntesis de litorina debe pasar por una serie de compartimentos celulares (lo que se denomina la vía secretora) antes de volverse funcional. El paso por la vía secretora ayuda a las proteínas a madurar por la adición de modificaciones postraduccionales. La vía secretora finaliza en la vacuola o fuera de la célula, dependiendo de la proteína. Aunque la levadura y las plantas contienen esta vía, la expresión de la enzima vegetal en la levadura no funcionó. Para acceder a la vacuola, una proteína necesita saber la “contraseña” correcta. Dicho de otra forma, las contraseñas de la planta y la levadura son completamente diferentes, de modo que la enzima se bloquea y no puede realizar su función.

Hay otra forma de conseguir que una proteína entre en una vacuola de levadura. Smolke y Srinivasan pensaron que podrían usar la ingeniería de proteínas para saltarse este requisito de la contraseña si disfrazaban la enzima como una clase específica de proteínas que se asientan en las membranas de la vía secretora. Estas proteínas son, efectivamente, VIP que tienen acceso automático a toda la vía secretora, incluida la vacuola. 

Después de pensar en cómo transportar la sintetasa de la litorina al interior de la vacuola, todo lo que quedaba era conseguir llevar la tropina (un precursor de la litorina) a la misma ubicación. Afortunadamente, las plantas ya han solucionado este problema y disponen de una proteína que transporta los productos químicos a través de la membrana de la vacuola. Con la expresión de esta proteína en la levadura, la vía biosintética queda completada. 

Fragmentos de gen Twist para la ingeniería de levaduras y la fermentación microbiana

Con el fin de recrear la biosíntesis de alcaloides tropánicos en la levadura, Smolke y Srinivasan utilizaron fragmentos de gen Twist para expresar todos los genes ajenos a la levadura. Esto incluye los “trasplantes” de enzimas directos de las plantas, las enzimas vegetales modificadas, los transportadores de alcaloides y las enzimas derivadas de otras eucariotas. Los fragmentos de gen Twist permiten la clonación directa y se benefician de una tasa de error baja líder del sector, lo que simplifica la construcción de vías biosintéticas complejas. 

A pesar de que ese estudio representa un logro significativo en la biología sintética, todavía queda trabajo para aumentar el rendimiento de 30-80 µg/l de este proceso de fermentación microbiana hasta los niveles de producción comercial (~5 g/l). Smolke y Srinivasan observaron que esto podría conseguirse optimizando las enzimas que conforman la vía biosintética, así como identificando nuevas proteínas que puedan ayudar en el encaminamiento intracelular. Aun así, esta tecnología innovadora es una de las vías metabólicas sintéticas más complejas de la documentación científica y proporciona una solución prometedora para la generación de compuestos terapéuticos complejos derivados de las plantas.