Kits de cribado de enzimas

Nuestras enzimas no se producen para un estándar de pureza específico. Aunque nos esforzamos por separarlas de los restos celulares y los componentes de la fermentación, es posible que haya algunas proteínas endógenas y sales tamponadoras. Estos componentes adicionales suelen mejorar la estabilidad.

No establecemos fechas de caducidad para las enzimas de investigación que todavía no se han producido a gran escala. Sin embargo, de acuerdo con nuestra experiencia, si se almacenan secas a –20 °C, la mayoría de nuestras enzimas permanecen estables durante 2 años.

Las enzimas del kit muestran una gran selectividad y normalmente se dividen de forma igualitaria entre la selectividad (R) y (S). Recomendamos cribar todas las enzimas en lugar de confiar únicamente en la notación histórica (consulte la tabla de selectividad a continuación), ya que los sustratos pueden adoptar conformaciones inusuales que afectan a la selectividad. Es importante tener en cuenta que la presencia de átomos que no sean de carbono en el sustrato (por ejemplo, halógenos o azufre) puede conllevar una selectividad opuesta debido a las convenciones de denominación de isómeros Cahn-Ingold-Prelog. Consulte la tabla de selectividad en la sección Protocolos.

La estabilidad y la actividad de las transaminasas pueden variar debido a diferentes factores interdependientes, lo que incluye diferentes sustratos y productos. A continuación, dispone de una tabla de parámetros habituales que proporciona parámetros de rendimiento que pueden ayudar a una mayor optimización tras el cribado.

El ácido pirúvico sirve como aceptor del grupo amino general para la mayoría de las enzimas de este kit y es ideal para probar el sistema de reacción.

Las condiciones de reacción habituales incluyen un aceptor amino 25 mM, 25 mM 2-(4-nitrofenil)etan-1-amino (aceptor amino), 100 mM tampón de fosfato potásico (pH 7,4) y 1 mM piridoxal 5-fosfato (PLP).

Recomendamos cribar en tampón de fosfato potásico con un pH 7,4 en un primer momento. Una vez identificados los aciertos, pueden optimizarse el tipo y el pH del tampón. La selectividad no suele depender del pH, aunque la actividad puede variar. El tampón de borato es apto para evaluar el rendimiento con un pH alto.

La mayoría de las enzimas del kit son estables con DMSO hasta 10 % v/v como codisolvente.

Las enzimas del kit funcionan con efectividad en un intervalo de pH de 7 a 8,5, con un subconjunto pequeño tolerante al pH de 9 a 10. No se recomienda reducir el pH por debajo de 7.0.

Las variantes muestran una estabilidad diferente, pero normalmente funcionan a entre 20 °C y 60 °C. Consulte la tabla de parámetros habituales para obtener más detalles.

Si el sustrato es soluble en DMSO y puede añadirse de forma equitativa a cada vial, la insolubilidad parcial en la mezcla de reacción no suele ser un problema.

Intente permitir que la reacción prosiga durante más tiempo, aumentando la temperatura (a 40 °C), aumentando la concentración del sustrato o aumentando la concentración enzimática. Si los problemas persisten, considere la posibilidad de consultar el kit de cribado de TA Twist®-bitBiome® o póngase en contacto con Twist para conocer más opciones. También puede ejecutar una reacción de control mediante ácido pirúvico como aceptor del grupo amino para verificar la solución de reacción.

Considere la posibilidad de detener antes la reacción o repetir la pantalla mediante una carga enzimática inferior. Si la repite, mantenga la concentración de DMSO a <10 % v/v.

Consulte nuestras preguntas frecuentes sobre el cribado de transaminasas para obtener sugerencias sobre la optimización de las condiciones de la reacción.

Los donantes de grupos amino habituales incluyen la alanina, la etilamina, la 1- y 2-propilamina, la 1- y 2-butilamina, y otros. La forma cetona/aldehído de estos donantes también actúan como buenos aceptores de grupos amino durante la resolución quiral.

Consulte las preguntas frecuentes sobre el cribado de transaminasas para obtener respuestas a otras preguntas que pueda tener o siéntase libre de contactar con nosotros.

Recomendamos preparar las soluciones frescas el día del experimento. Con el paso del tiempo, el sustrato y el cofactor pueden degradarse, lo que podría reducir el rendimiento general de la reacción. Si necesita almacenar y reutilizar la solución, deberán conservarse fría y protegida de la luz. Asimismo, recomendamos comprobar su rendimiento con respecto a las soluciones frescas cuando sea posible.

Para muchas enzimas, incorporar DMSO al 10 % v/v en la mezcla de reacción y aumentar la temperatura a 40-45 °C puede aumentar la solubilidad del sustrato. Consulte la tabla de parámetros habituales para conocer las condiciones habituales toleradas por cada enzima. Asimismo, el aumento del pH puede ayudar a la solubilidad, aunque esto varía en función del sustrato. No recomendamos un pH inferior a 7.0. La turbidez de la mezcla de reacción, que indica una solubilidad incompleta del sustrato, suele ser aceptable y no suele impedir la reacción. Es mejor añadir el sustrato neto o desde una solución de DMSO (o disolvente similar) para garantizar una distribución homogénea en todas las reacciones.

Normalmente resulta óptimo añadir la enzima después de incorporar todos los demás reactivos y disolventes, y de que se haya completado el ajuste del pH. Si es factible, disuelva la enzima en el tampón antes de añadirlo a la mezcla de reacción. En ocasiones, modificar el orden de la adición de reactivos puede afectar significativamente al rendimiento de la reacción, tanto positiva como negativamente.

Es fundamental comprender la naturaleza inherente tanto del sustrato como del producto, ya que estas son propiedades que la enzima no puede modificar (por ejemplo, estabilidad de la solubilidad, el pH y la temperatura). Asimismo, es importante evitar condiciones que puedan fomentar reacciones secundarias, lo que puede provocar problemas posteriores o incompatibilidad con el sustrato o producto. Evalúe el rendimiento de la reacción a diferentes niveles de pH (recomendado: pH 7,4, 9 y 10 con un tampón de fosfato potásico a un pH 7,4 y borato de sodio a un pH 9 y 10). Una vez determinado el pH óptimo, investigue el efecto de la temperatura en el rendimiento de la reacción (intervalo de temperatura recomendado: 30-55 °C). Asimismo, considere la evaluación de la reacción a cargas de sustrato más altas para optimizar el rendimiento. Si el sustrato no es soluble en la mezcla de reacción, puede provocar la limitación de la transferencia de masa del sustrato. En dicho casos, considere la investigación de la adición de un codisolvente solubilizador. Consulte la tabla de parámetros habituales para conocer la tolerancia de la concentración de disolventes; además también pueden explorarse el DMSO, otros disolventes, como los alcoholes de cadena corta, el DMF, el THF y el acetonitrilo.

Comprobamos la actividad de cada enzima en cada lote mediante un método colorimétrico estándar. Esto garantiza que cada enzima cumpla los estándares de actividad y funcione de forma fiable en sus aplicaciones.

Medimos el polvo de lisado de enzimas específicas del kit de cada lote. Esta medición garantiza que haya una cantidad adecuada de lisado y, así, la efectividad de nuestros kits.

Para garantizar la seguridad medioambiental, confirmamos que no hay huéspedes de expresión vivos (como E. coli) en el polvo de lisado. Este paso es crucial para mantener la seguridad e integridad de nuestro producto.

Realizamos pruebas rigurosas para confirmar la vida útil de cada lote. Esto garantiza que nuestros kits de enzimas sigan siendo efectivos y estables durante la realización de su uso previsto.

La ausencia de huéspedes de expresión vivos, como la E. coli, en el polvo de lisado es importante para evitar cualquier posible contaminación y para garantizar la seguridad de los usuarios y del entorno.

Un método colorimétrico es una técnica usada para determinar la concentración de una enzima en función de su cambio de color cuando reacciona a un sustrato específico. Se utiliza porque proporciona una medición fiable y cuantificable de la actividad enzimática.

Si un lote no cumple nuestros estrictos estándares de calidad, no se comercializa. En su lugar, se somete a un análisis más exhaustivo y a acciones correctivas para solucionar cualquier problema antes de poder replantearse su distribución.

Nuestros procesos de control de calidad se realizan usando métodos y equipos utilizados por profesionales formados. También se realizan auditorías y revisiones regulares para garantizar la conformidad continua con los estándares y las prácticas recomendadas del sector.

Sí, los clientes solicitar informes detallados de control de calidad para su lote específico. Estos informes proporcionan transparencia y garantías en lo que respecta la calidad y la integridad del kit de enzimas que reciben.