La herramienta de optimización de codones Twist asigna aleatoriamente codones sinónimos en función de las preferencias de codones del organismo seleccionado. A continuación, se muestra una lista de consideraciones durante la optimización:

• Asignamos codones más comunes con más frecuencia que los menos comunes
• Evitamos el uso de codones raros (aquellos con una frecuencia de codones < 8 %)
• Nos aseguramos de que las secuencias no tengan horquillas fuertes (ΔG < -8) en los primeros 48 pares de bases de las secuencias resultantes
• Verificamos ambas hebras para asegurarnos de que no contengan los sitios de corte de enzimas que nos pidió que evitáramos
• Evitamos la introducción de secuencias promotoras internas a las secuencias de expresión evitando la creación de sitios de unión fuerte a sigma70
• Evitamos secuencias que creen sitios de unión fuerte a ribosomas (GGAGG y TAAGGAG)
• Evitamos secuencias que creen secuencias terminadoras (TTTTT o AAAAA). Dado que no siempre se asigna el codón de preferencia, no debe esperar ver el mismo resultado después de cada intento de optimización (no hay asignación de codón a aminoácido 1:1).
• Si optimiza la misma secuencia varias veces, debería esperar ver una secuencia optimizada diferente.

Tenga en cuenta que no se puede garantizar la expresión óptima para ninguna secuencia que pase por la optimización de Twist, ya que hay muchos factores que intervienen en la expresión de calidad, algunos de los cuales no se comprenden bien.

Factores adicionales, como la estabilidad del ARN mensajero, la maduración de la proteína, la velocidad de traducción, la expresión de chaperonas, el diseño del promotor, el vector de expresión, etc., también influyen en la expresión.